转基因技术是植物反向遗传学和生物技术的重要工具。靶向基因修饰可以揭示所关注基因的功能，改变代谢和调节途径，或得到有价值的蛋白质及代谢物的积累。然而，为了有效地设计靶向基因修饰，嵌合基因构建，特别是用来控制转基因表达的启动子需要仔细选择。在广泛使用的载体中，大多数启动子都属于强的和组成型表达的变体启动子。然而，在许多情况下，转基因的表达必须限制在特定的组织、发育阶段或对某些内部或外部刺激的反应中。目前已有大量文献报道了组织特异性启动子的研究，并且相关的信息也比较全面。选择合适的启动子用于基因构建可优化转基因的转录模式，因此，伯小远在这里给大家介绍一个转基因启动子数据库（TGP；http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbases/tgp/home.html），该数据库收集了该领域的文献发表信息，希望在今后的科研之路中对大家的实验有所帮助。

01 前 言

利用转基因方法进行植物研究，往往需要选择具有适当转录活性的启动子。嵌合基因构建中常用的启动子组非常有限，只能提供有限的基因表达模式变异。此外，在一个复杂载体构建中使用两个相同的启动子会导致转基因沉默。虽然这个问题可以通过使用多种具有实验验证特性的植物基因启动子来解决，但它需要对文献数据进行一个比较详细的分析。在这里给大家介绍一个转基因启动子数据库（TGP；http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbases/tgp/ home.html），该数据库对已知特征的植物启动子进行了注解（Smirnova et al., 2012a；Smirnova et al., 2012b)。TGP收集了关于启动子核苷酸序列及其在转基因植物中的特异性活性的数据。虽然还远未完成，但该数据库已经定期更新，注释植物启动子的列表也在不断扩大。TGP可以用于选择具有适合特定实验需求特性的候选启动子。

在本次的文章中简要总结了关于各种组织特异性和发育调节的植物启动子的现有文献数据的统计，它们的活性已经用转基因植物进行了实验评估。在这里对于每一类启动子简单列举了一到两个例子。启动子的表达模式通常是通过评价β-葡萄糖苷酸酶（GUS）或绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的表达来确定的。TGP对于每个启动子，标注了其大小、位置、表达水平和测试启动子的植物组织。其中一些已经在TGP数据库中被注释的文件被相应的标识符引用，从而可以从TGP数据库中获得启动子活性和启动子序列的相关信息。

这次的介绍不包括一些广为人知的启动子，这些启动子的信息通常是可获得的。相反，这里提供了一些在某些情况下从外来物种中分离出来的组织特异性和发育调节启动子的信息，这些信息有可能用于转基因研究。其中一些启动子具有保守的调控元件，可用来控制异源物种中靶基因的表达。

02启动子类型

2.1 水果特异性启动子

许多水果的特异性启动子已被鉴定，并显示其可指导报告基因的特异性表达（表1）。番茄通常可被用来确定生命周期长或难以转化的水果特异性启动子的活性，番茄果实有几个成熟阶段：绿色、破色、转色、粉红色和红色（DellaPenna et al., 1986）。在破色阶段，果实的颜色开始从外部可见。在成熟期，果实的红色为10%至30%左右。

举个栗子：

聚半乳糖醛酸酶（PGA）是参与水果成熟的酶之一。对猕猴桃聚半乳糖醛酸酶基因启动子在番茄（Lycopersicon esculentum cv. UC82B）中的表达进行研究。CkPGA启动子片段（从转录起始位点的-467至+189、-860至+189和-1296至+189的位置）指导报告基因GUS在转基因番茄中特异性表达（Wang et al., 2000）。破色期之前，在叶片、根、花、脱落区和正在发育的果实中未检测到组织化学染色；破色期的番茄果实内、外果皮、轴柱和种子均有染色，而维管束中的染色最强；在成熟后期，染色通常仅限于内果皮和种子中。此外，在这些阶段，-1296 CkPGA启动子片段比-860或-467融合体的GUS染色更弱。

2.2 花特异性启动子

为了人工改善植物花器官特别是胚器官的形态或生理现象或者为了检测花器官中不同基因的功能，需要在花器官中显示特异性表达的启动子。

举两个栗子：

苹果花青素合成酶基因（MdANS）优先表达于红色的果皮中。MdANS1启动子在生殖器官中活性高，而在营养器官中活性低，这与MdANS1（Kim et al., 2006）在生殖器官中的优先表达一致。在转基因烟草的花蕾萼片、成熟花花瓣、花托和发育种子中均检测到了GUS活性。在萼片和成熟花瓣中，GUS活性主要存在于毛状体中，而表皮组织中活性较弱。在花瓣，维管组织中则表现出较强的活性。在果实发育过程中，未成熟种子的齿状表皮细胞活性显著，而胎盘细胞活性较弱。在花托中心检测到较强的活性。不同类型的烟草和苹果果实发育可能是转基因烟草果皮中GUS活性较弱的原因，这是由于烟草果实是由子房发育而成的开裂蒴果，而苹果果实是不开裂的果肉，被托杯发育为果实薄壁组织。苹果植株的转化将为MdANS1的确切表达位置提供直接的答案，开发种皮特异性启动子将有助于提高种皮组织中的果实颜色等生物学特性（表1）（Kim et al., 2006）。

表1 果肉与花特异性启动子

番茄植物烯去饱和酶基因启动子（LePDS，从转录起始位点的-1549 至 +564位置）在转基因番茄和烟草植株中可驱动发育调控的GUS表达。在番茄中，高水平的GUS表达存在于各器官和形成染色体的发育阶段：花瓣、花药、花冠以及成熟的红色果实中。烟草花瓣和果实不含染色体，因此GUS表达水平较低。在1038bp的LePDS启动子（-459至+579，距离转录起始位点的位置）调控下，红球藻中编码β -胡萝卜素酮酶的CrtO基因的cDNA被转移到烟草中，该启动子在花瓣中表达水平最高（Mann et al., 2000）。利用代谢工程技术，对烟草类胡萝卜素的生物合成途径进行了改造，以生产具有重要经济价值的红色色素虾青素。转基因植物蜜腺组织中的着色体积累了虾青素等类酮类胡萝卜素，使蜜腺的颜色由黄色变为红色。一个被截断的733bp的LePDS启动子（从第5’端移除305bp）在烟草子房中的表达水平最高（TGP Le:PDS）。

2.3 花药/花粉特异启动子

花药/花粉特异性启动子可用于植物雄性不育的基因工程和花粉/绒毡层特异性基因的功能研究（表2）。

表2 花药/花粉特异启动子

举个栗子：

从豌豆（Pisum sativum cv. Alaska）花药特异性基因中分离到一个PsEND1启动子（从转录起始位点的-2752 至 -22位置）。PsEND1启动子只在转基因拟南芥、烟草、番茄的花药中起作用（Gomez et al., 2004）。GUS活性在花药发育的早期被检测到，并且在豌豆中，END1基因在其它组织（表皮、结缔组织、内膜和中层细胞）中也可被检测到。雄蕊丝、中央维管、绒毡层、花粉母细胞和成花粉均无GUS活性。在转基因植物的花、叶、茎和根中未观察到GUS活性（Gomez et al., 2004）。在转基因面包小麦品种山齿鹑的成熟花粉中也发现了GUS活性（Piston et al., 2008）。PsEND启动子与解淀粉芽孢杆菌的细胞毒性核酸酶基因barnase融合，诱导PsEND在细胞层的特异性表达，从而产生雄性不育植株。使用PsEND启动子而不是绒毡层特异性启动子在小孢子母细胞分化之前阻止了小孢子的发生，并且不产生有活性的花粉。

2.4 种子特异性启动子

在种子发育过程中，种子特异性蛋白高水平表达。目前已鉴定出许多种子特异性启动子，如小麦谷蛋白和麦胶蛋白、玉米醇溶蛋白、豌豆凝集素和豆荚素、豆类植物血凝素、大豆球蛋白和β-聚球蛋白、水稻谷蛋白和脯氨蛋白等。

举个栗子：

拟南芥硝酸盐转运蛋白NRT2.7在种子的硝酸盐积累中起着特殊作用。AtNRT2.7转录本在干燥的种子中积累。AtNRT2.7启动子（从转录起始位点的-2000至-1位置）在转基因拟南芥胚中表达高水平的GUS或GFP，而在胚乳种皮中低表达（表3）（Chopin et al., 2007）。

表3 种子特异性启动子

2.5 根系特异性启动子

根系优先启动子可用于驱动根系特异性基因的表达，以提高根系对病虫害、营养和水分缺乏以及盐、冷或干旱胁迫的抗性。

举个栗子：

拟南芥NRT2.1基因编码一种参与根吸收硝酸盐的高亲和力转运体。在转基因拟南芥中，AtNRT2.1启动子（从转录起始位点的-1201至-1位置）的活性主要位于根较老部位的皮质区（Girin et al., 2007）。而在地上部分，AtNRT2.1启动子的活性非常低，仅限于叶下裂膜。AtNRT2.1启动子活性在蔗糖和硝酸盐存在时上调，并被下游N代谢物抑制。这些调控需要150bp的序列（从-245到-95）。在转基因番茄植株中，AtNRT2.1启动子（从转录起始位点-1154 至 -65的位置）在根的维管区有活性，但在叶片中明显不存在。在AtNRT2.1启动子的调控下，合成几丁质酶基因（NIC）的表达比非转基因番茄植株对根病原菌镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抗性水平更高（Kong et al., 2014）（TGP At:NRT2.1）（表4）。

表4 根系特异性启动子

2.6 发育调控启动子

发育调控启动子对于研究植物的生长发育以及衰老过程具有重要的意义。例如，我们可以在某些情况下延迟或提前植物的衰老以达到特定的目的。

举个栗子：

拟南芥衰老相关基因AtSAG12启动子是目前研究最广泛的发育调控植物启动子（TGPAt:SAG12）。SAG12在幼叶中不表达，随着拟南芥叶片衰老过程的进行，其表达量不断增加（Noh et al., 1999；Zimmermann et al., 2006）。AtSAG12启动子（从转录起始位点-2073 至 +10的位置）在拟南芥（Huynh et al., 2005）、烟草（Cowan et al., 2005；Gan et al., 1995；Jordi et al., 2000；Ori et al., 1999）、水稻（Fu et al., 1998）、莴苣（McCabe et al., 2001）、矮牵牛花（Chang et al., 2003）、番茄（Swartzberg et al., 2008；Swartzberg et al., 2011）、小麦（Merewitz et al., 2011）、匍匐草（Xu et al., 2010）、木薯（Zhang et al., 2010）、非洲菊（Lai et al., 2007）、天竺葵（Garcia-Sogo et al., 2012）中均有特异性的衰老表达。在瞬时表达分析中，AtSAG12启动子（从转录起始位点-1345 至+87的位置）驱动GUS在矮牵牛花衰老叶片和花中表达较强，在幼叶、鲜花和根中表达较弱。启动子也可以驱动GUS在水仙、黄花菜和兰花衰老花冠中的表达，尽管在兰花中GUS的表达水平相对较低（Xu et al., 2007）。将农杆菌细胞分裂素生物合成IPT基因表达的AtSAG12-IPT基因构建物导入不同植物中延缓衰老（表5）。

表5 发育调控启动子

伯小远叨叨

1、本文提出的组织特异性和发育调控的启动子具有广泛的活性和表达模式，为植物生物技术的应用提供了指导。必须仔细选择启动子的大小，因为不同的启动子缺失突变体可能有不同的组织特异性。

2、在不同的转基因物种中，包括单子叶植物和双子叶植物，启动子均能驱动基因表达，表明这些启动子在组织特异性表达靶基因方面具有广泛的应用潜力。

References:

Chang H, Jones ML, Banowetz GM, Clark DG (2003) Overproduction of cytokinins in petunia flowers transformed with P(SAG12)-IPT delays corolla senescence and decreases sensitivity to ethylene. Plant Physiol 132:2174–2183

Chopin F, Orsel M, Dorbe MF, Chardon F, Truong HN, Miller AJ, Krapp A, Daniel-Vedele F (2007) The Arabidopsis ATNRT2.7 nitrate transporter controls nitrate content in seeds. Plant Cell 19:1590–1602

Cowan AK, Freeman M, Bjorkman PO, Nicander B, Sitbon F, Tillberg E (2005) Effects of senescence-induced alteration in cytokinin metabolism on source-sink relationships and ontogenic and stress-induced transitions in tobacco. Planta 221:801–814

DellaPenna D, Alexander DC, Bennett AB (1986) Molecular cloning of tomato fruit

polygalacturonase: analysis of polygalacturonase mRNA levels during ripening. Proc Natl Acad Sci U S A 83:6420–6424

Fu Y, Ding Y, Liu X, Sun C, Cao S, Wang D, He S, Wang X, Li L, Tian W (1998) Rice transformation with a senescence-inhibition chimeric gene. Chin Sci Bull 43:1810–1815

Gan S, Amasino RM (1995) Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science 270:1986–1988

Garcia-Sogo B, Pineda B, Roque E, Anto´n T, Atare´s A, Borja M, Beltra ´n JP, Moreno V, Can ˜as LA (2012) Production of engineered long-life and male sterile Pelargonium plants. BMC Plant Biol 12:156

Girin T, Lejay L, Wirth J, Widiez T, Palenchar PM, Nazoa P, Touraine B, Gojon A, Lepetit M (2007) Identification of a 150 bp cis-acting element of the AtNRT2.1 promoter involved in the regulation of gene expression by the N and C status of the plant. Plant Cell Environ 30:1366–1380

Gomez MD, Beltran JP, Canas LA (2004) The pea END1 promoter drives anther-

specific gene expression in different plant species. Planta 219:967–981

Huynh le N, Vantoai T, Streeter J, Banowetz G (2005) Regulation of flooding tolerance of SAG12:ipt Arabidopsis plants by cytokinin. J Exp Bot 56:1397–1407

Jordi W, Schapendonk A, Davelaar E, Stoopen GM, Pot CS, De Visser R, Van Rhijn JA, Gan S, Amasino RM (2000) Increased cytokinin levels in transgenic PSAG12-IPT tobacco plants have large direct and indirect effects on leaf senescence, photosynthesis and N partitioning. Plant Cell Environ 23:279–289

Kim SH, Lee JR, Kim SR (2006) Characterization of an apple anthocyanidin synthase gene in transgenic tobacco plants. J Plant Biol 49:326–330

Kong K, Makabe S, Ntui VO, Khan RS, Nakamura I (2014) Synthetic chitinase gene driven by root-specific LjNRT2 and AtNRT2.1 promoters confers resistance to Fusarium oxysporum in transgenic tobacco and tomato. Plant Biotechnol Rep 8:151–159

Lai QX, Bao ZY, Zhu ZJ, Qian QQ, Mao BZ (2007) Effects of osmotic stress on antioxidant enzymes activities in leaf discs of PSAG12-IPT modified Gerbera. J Zhejiang Univ Sci B 8:458–464

Mann V, Harker M, Pecker I, Hirschberg J (2000) Metabolic engineering of astaxanthin production in tobacco flowers. Nat Biotechnol 18:888–892

Merewitz EB, Gianfagna T, Huang B (2011) Photosynthesis, water use, and root viability under water stress as affected by expression of SAG12-ipt controlling cytokinin synthesis in Agrostis stolonifera. J Exp Bot 62:383–395

McCabe MS, Garratt LC, Schepers F, Jordi WJ, Stoopen GM, Davelaar E, van Rhijn JH, Power JB, Davey MR (2001) Effects of P (SAG12)-IPT gene expression on development and senescence in transgenic lettuce. Plant Physiol 127:505–516

Noh YS, Amasino RM (1999) Identification of a promoter region responsible for the senescence-specific expression of SAG12. Plant Mol Biol 41:181–194

Ori N, Juarez MT, Jackson D, Yamaguchi J, Banowetz GM, Hake S (1999) Leaf senescence is delayed in tobacco plants expressing the maize homeobox gene knotted1 under the control of a senescence-activated promoter. Plant Cell 11:1073–1080

Piston F, Garcia C, de la Vina G, Beltran JP, Can ˜as LA, Barro F (2008) The pea PsEND1 promoter drives the expression of GUS in transgenic wheat at the binucleate microspore stage and during pollen tube development. Mol Breed 21:401–405

Smirnova OG, Ibragimova SS, Kochetov AV (2012a) Simple database to select promoters for plant transgenesis. Transgenic Res 21:429–437

Smirnova OG, Rasskazov DA, Afonnikov DA, Kochetov AV (2012b) TGP—the database on promoters for plant transgenesis. Mat Biolog Bioinform 7:444–460. [Article in Russian]

Swartzberg D, Kirshner B, Rav-David D, Elad Y, Granot D (2008) Botrytis cinerea induces senescence and is inhibited by autoregulated expression of the IPT gene. Eur J Plant Pathol 120:289–297

Swartzberg D, Hanael R, Granot D (2011) Relationship between hexokinase and cytokinin in the regulation of leaf senescence and seed germination. Plant Biol (Stuttg) 13:439–444

Wang ZY, MacRae EA, Wright MA, Bolitho KM, Ross GS, Atkinson RG (2000) Polygalacturonase gene expression in kiwifruit: relationship to fruit softening and ethylene production. Plant Mol Biol 42:317–328

Xu Y, Gianfagna T, Huang B (2010) Proteomic changes associated with expression of a gene (ipt) controlling cytokinin synthesis for improving heat tolerance in a perennial grass species. J Exp Bot 61:3273–3289

Xu X, Jiang CZ, Donnelly L, Reid MS (2007) Functional analysis of a RING domain ankyrin repeat protein that is highly expressed during flower senescence. J Exp Bot 58:3623–3630

Zhang P, Wang WQ, Zhang GL, Kaminek M, Dobrev P, Xu J, Gruissem W (2010) Senescence-inducible expression of isopentenyl transferase extends leaf life, increases drought stress resistance and alters cytokinin metabolism in cassava. J Integr Plant Biol 52:653–669

Zimmermann P, Heinlein C, Orendi G, Zentgraf U (2006) Senescence-specific regulation of catalases in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell Environ 29:1049–1060