由于菌种的衰退将会引起发酵过程的产量急剧下降，一旦发生菌种衰退，就必须采取有效的预防和防治措施，防止菌种的优良性状发生退化。同时若发现某些优良性状退化，应及时进行分离纯化，使生产菌种保持稳定的优良特性。防止菌种衰退的措施主要有菌种的复壮、提供良好的环境条件、定期纯化菌种、防止自身突变等各个方面。

一、菌种衰退的原因

1、遗传变异

自发突变：微生物在传代过程中可能发生基因突变，导致目标性状（如产酶能力、抗生素产量）下降。质粒丢失：某些工业菌株的性状由质粒携带（如降解能力），质粒不稳定易丢失。

2、环境压力

非最适培养条件：长期在不适宜温度、pH或营养条件下培养，会筛选出低效突变株。污染：杂菌竞争或噬菌体感染导致目标菌株退化。

3、人为因素

传代操作不当：如接种量不足、保藏方法错误（如反复冻融）。定向选择缺失：未定期筛选高产菌株，导致低效菌株占据优势。

二、菌种衰退的表现

1、菌种遗传特性的改变

具有菌种优良性状和大量生成目的产物的高产菌株往往表现出活力弱、生长繁殖速度慢的特点，多次传代会使得繁殖能力高的变异菌或低产菌比例增加。菌种保藏条件不当也会使菌种发生变异，例如冷冻干燥会对菌体细胞的结构和DNA造成损伤，在修复这些损伤时，菌体就可能发生变异。

2、菌种生理状况的改变

由于培养条件不适当，使菌种处于不利于发酵生产的生理状况，其结果也表现为菌种衰退。菌种处于不利于发酵的生理状况有以下三个方面的原因：

菌种在不同培养基上具有不同的生长特性。一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性；单菌落菌种在固体培养基上分离可以长出许多种形态培养特征的菌落，各种类型菌落所占的比例也不同。在开始菌种选育工作时，要研究单菌落的分离培养基，找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间存在着某种程度的相关性。在选种实践中，人们经过对菌落形态的考察，有意识地挑选那些可能高产的菌落。菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，因而影响发酵；菌种培养基营养贫乏也同样不利于发酵，因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老，甚至死亡。因此，菌种培养基应具有菌种传代后生产能力下降不明显、菌体不易衰老和自溶的特点。在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。这种改变可能以类似于生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间。

三、防止菌种衰退的措施

1、菌种的分离

菌种发生衰退的同时，并不是所有的菌种都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的、具有更强生命力的菌体。因此，采用单细胞菌株分离措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞长成的菌落，再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来性状的菌株，甚至性能更好的菌株。如对芽孢杆菌，可先将菌液用沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。如果遇到某些菌株即使进行单细胞分离仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，以达到复壮的目的。例如，AT3.942栖土曲霉（Asp.terricola）的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。同时，通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。菌种分离方法如下：

配合一定的培养条件，对退化菌株进行单菌落或单细胞分离，淘汰退化的个体，保留纯化菌种。将芽孢杆菌的悬液加热至90℃，处理数分钟，杀灭已退化的菌体，保留芽孢；再将芽孢或孢子进行传代，以淘汰退化的个体。提供特殊的培养条件，使环境有利于优良性状菌株的生长而不利于退化菌株的生长，从而淘汰已退化的菌株个体。将分离后得到的初筛菌株先保藏，再进行复筛考察，从中选出稳定性较好的菌种。

同时应用上述方法中的两种或两种以上的方法，会收到更好的复壮效果。

2、提供良好的环境条件

进行合理的传代、减少传代次数可防止由于菌种的遗传稳定性变化而引起的自发突变，以及由于环境条件变化导致的退化。菌种允许使用的传代次数必须通过传代的稳定性试验确定。发酵生产中一般只用三代内的菌种。采用合适的传代条件使培养条件有利于高产菌的生长，而不利于低产菌的生长，减少突变的发生。

3、优良的保藏方法

尽可能采用诸如斜面冰箱保藏法、砂土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法以及采用干孢子保藏等优越的保藏方法保藏菌种，以防止菌种的衰退。

4、定期纯化菌种

对菌种进行定期的分离纯化，可减少其中共存的自发突变菌或“突变不完全”产生的退休型菌株的增殖机会，保持原来的优良特性。诸如对营养缺陷型菌种在纯化过程中提供足够的营养物，以保持菌株的优势，避免回复突变体的竞争。同样，在进行抗性突变的菌种纯化时，在培养基中加入对应于抗性的药物，可保持菌株的抗性优势，避免产生无抗性的回复突变体。

四、菌种的复壮

菌种的复壮有狭义的复壮和广义的复壮。狭义的复壮指的是菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。而广义的复壮应该是一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高，所以，这实际上是一种利用自发突变（正突变）从生产中不断进行选种的工作。

1. 常规复壮技术

单菌落分离：通过平板划线或稀释涂布，挑选形态典型的单菌落，恢复原始性状。宿主复壮：针对病原菌或共生菌，重新接种至宿主（如植物或动物）以恢复毒力/共生能力。优化培养条件：调整培养基成分（如碳氮比）、温度、溶氧等，消除环境压力。

2. 遗传水平复壮

诱变育种：采用UV、化学诱变剂（如亚硝基胍）或CRISPR技术，重新引入正向突变。基因工程：通过质粒导入或基因编辑（如过表达关键基因）恢复目标功能。

3. 其他策略

定期保藏：采用液氮超低温（-196℃）或冷冻干燥法长期保存原始菌种，减少传代次数。竞争筛选：在培养基中添加抗生素或特定底物，压力下筛选高性能菌株（如仅高产菌能存活）。

五、案例应用

1、抗生素生产菌（如青霉素产黄青霉）： 衰退表现为产量下降20%以上，通过单孢子分离和培养基优化（如乳糖替代葡萄糖）复壮。

2、工程菌（如大肠杆菌表达系统）： 质粒丢失导致蛋白表达量降低，需添加抗生素压力筛选或重新转化。