14. 如果存在非特异性扩增条带，如何提高产物特异性？

Ø 使用BLAST确定引物的3’端是否有与目标位点以外的位点互补，可重新设计引物或调整PCR条件。

Ø 完善PCR反应条件：设置梯度退火温度和退火时间；减少PCR循环数；使用touchdown PCR；改为两步法PCR

Ø 调整模板用量

15. 如果PCR产生错误，应该怎么办？

为了避免PCR过程中的错误，建议使用高保真酶。

避免以下影响因素：

过度循环：过度循环PCR反应经常会出现。

注：影响pH值，导致错误的发生

增加PCR产物的量，从而降低聚合酶的效率，导致错误的发生

降低了dNTP的数量，体系中不用浓度的dNTP导致的碱基配对错误的可能性。

Mg2+浓度过高：使用高浓度的Mg2+可以提高产量，但也会影响酶的校正活性。PCR体系中Mg2+浓度应该始终高于dNTP浓度。

模板DNA损伤：在分析或切胶回收PCR产物时，尽量缩短紫外线照射时间。

16. PCR扩增无目的条带产生的原因?

PCR反应的关键环节：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量；④PCR条件。

模板：

a．模板中含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白。b．模板中含有Taq酶抑制剂。c．模板核酸变性不彻底。d．选择质量可靠的提取试剂。e．靶序列变异。

如靶序列发生突变，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR不能有效扩增。

引物：

a．引物设计不合理，如引物长度不够、引物之间形成二聚体等，需要重新设计引物。

b．合成高质量、高纯度级别的引物。c．引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期4℃保存，导致引物降解失效。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或活性降低而导致没有产物。

PCR条件：

a．PCR扩增条件：变性对PCR扩增相当重要，如变性温度低、变性时间短都有可能出现扩增无产物；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。b．Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败。c．反应体系：通常在进行PCR时需要先摸索条件。

17. PCR产物电泳出现拖尾现象（“Smear”），该如何改善结果？

使用阳性和阴性（无模板）对照来确定拖尾的来源。如果阴性对照为空白，则无污染。如果阴性对照也出现拖尾，则存在污染，需要确定这种污染的来源。

引物设计不合理或PCR条件不理想产生的，或过度循环产生。

优化以下条件：a. 减少模板添加量；b. 提高退火温度；c. 使用touchdown PCR；d. 减少PCR循环数；e.重新设计引物；d.重新扩增PCR产物。

18. PCR扩增出现假阳性的原因?

假阳性条带与目的序列条带大小一致，有时其条带更整齐，亮度更高，

原因：

引物设计不合理：a．选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，扩增出的PCR产物为非目的性序列。b．靶序列或引物太短，出现假阳性。

出现污染：a．交叉污染。b．空气中的核酸污染。